جینیاتی مطالعہ کرنے کے عمل میں، ہمیں اکثر ناکافی RNA نمونوں کا سامنا کرنا پڑتا ہے، مثال کے طور پر، چھوٹے جسمانی زبانی ٹیومر، یہاں تک کہ واحد خلیے کے نمونے، اور مخصوص جین کے تغیرات کے نمونوں کا مطالعہ کرنے کے لیے جو انسانی خلیات میں انتہائی نچلی سطح پر نقل کیے جاتے ہیں۔بلاشبہ، COVID-19 ٹیسٹ کے لیے، اگر نمونے لینے کے دوران جھاڑو صحیح جگہ پر نہیں ہیں یا کافی وقت نہیں ہیں، تو نمونے کا سائز بہت کم ہوگا، یہی وجہ ہے کہ کمیشن آف ہیلتھ اینڈ فیملی پلاننگ دو دن پہلے سامنے آیا تھا اور ٹیسٹ پاس کیا، اور اگر نیوکلک ایسڈ کے نمونے لینے والے نے چھ نمونے نہیں لیے، تو آپ اس کی اطلاع دے سکتے ہیں۔
ریجنٹ کی حساسیت اہم ہے کیونکہ ہمیں یہ مسئلہ یا وہ مسئلہ ہے، تو ہم RT-PCR کی حساسیت کو بہتر بنانے کے لیے کیا کر سکتے ہیں؟
اس سے پہلے کہ ہم ممکنہ حل پر بات کریں، آئیے اس صورت حال کے ساتھ دو بڑی پیچیدگیوں کا ذکر کرتے ہیں جن کا ہم نے ابھی ذکر کیا۔
سب سے پہلے، ہم آر این اے کے نقصان کے بارے میں فکر مند ہوتے ہیں جب ہمارے نمونے میں صرف چند سیل کی آبادی ہوتی ہے۔اگر علیحدگی اور صفائی کے روایتی طریقے استعمال کیے جائیں، جیسے کالم کا طریقہ یا نیوکلک ایسڈ بارش کا طریقہ، تو اس بات کا بہت زیادہ امکان ہے کہ چند نمونے ضائع ہو جائیں گے۔ایک حل یہ ہے کہ ایک کیریئر مالیکیول شامل کیا جائے، جیسے کہ tRNA، لیکن اس کے باوجود، اس بات کی کوئی گارنٹی نہیں ہے کہ ہمارا بحالی کا تجربہ ٹھیک ہے۔
تو اس سے بہتر طریقہ کیا ہے؟مہذب خلیوں یا مائیکرو ایناٹومیکل نمونوں کے لیے ایک اچھا آپشن براہ راست لیسس کا استعمال ہے۔
خیال یہ ہے کہ خلیات کو 5 منٹ کے لیے تقسیم کریں، RNA کو محلول میں چھوڑ دیں، پھر 2 منٹ کے لیے رد عمل کو روکیں، پھر lysate کو براہ راست ریورس ٹرانسکرپشن ری ایکشن میں شامل کریں تاکہ کوئی RNA ضائع نہ ہو، اور آخر میں نتیجے میں سی ڈی این اے کو براہ راست ڈال دیں۔ اصل وقت کے رد عمل میں۔
لیکن کیا ہوگا اگر، ایک محدود نقطہ آغاز یا ہدف جین کے اظہار کی تھوڑی مقدار کی وجہ سے، ہم تمام آر این اے کو ری سائیکل کر سکتے ہیں اور پھر بھی ایک اچھا ریئل ٹائم سگنل حاصل کرنے کے لیے کافی ٹیمپلیٹس فراہم نہیں کر سکتے؟
اس صورت میں، پری ایمپلیفیکیشن مرحلہ بہت مفید ہو سکتا ہے۔
ریورس ٹرانسکرپشن کے بعد حساسیت بڑھانے کے لیے درج ذیل اسکیم ہے۔شروع کرنے سے پہلے، ہمیں نیچے کی طرف سے پوچھنے کی ضرورت ہے کہ ہم کن اہداف میں دلچسپی رکھتے ہیں، تاکہ ان اہداف کے لیے پری ایمپلیفیکیشن کے لیے مخصوص پرائمر ڈیزائن کریں۔
یہ ایک مخلوط پرائمر بنا کر حاصل کیا جا سکتا ہے جس میں 100 جوڑے پرائمر اور 10 سے 14 بار ری ایکشن سائیکل بنا کر حاصل کیا جا سکتا ہے۔لہذا، حاصل کردہ سی ڈی این اے کو پہلے سے بڑھانے کے لیے خاص طور پر اس ضرورت کے لیے تیار کردہ ایک ماسٹر مکس کی ضرورت ہے۔
10 اور 14 کے درمیان سائیکلوں کی تعداد مقرر کرنے کی وجہ یہ ہے کہ سائیکلوں کی یہ محدود تعداد مختلف اہداف کے درمیان بے ترتیب ہونے کو یقینی بناتی ہے، جو ان محققین کے لیے بہت اہم ہے جنہیں مقداری مالیکیولر معلومات کی ضرورت ہوتی ہے۔
پری ایمپلیفیکیشن کے بعد، ہم بڑی مقدار میں سی ڈی این اے حاصل کر سکتے ہیں، تاکہ بیک اینڈ پر پتہ لگانے کی حساسیت بہت بہتر ہو جائے، اور ہم نمونے کو کم کر سکتے ہیں اور ممکنہ بے ترتیب غلطیوں کو ختم کرنے کے لیے متعدد ریئل ٹائم پی سی آر ری ایکشن بھی کر سکتے ہیں۔
پوسٹ ٹائم: اپریل 11-2023